「WB急救室」之条带弱、无信号，5步操作细节助你锁定实验室“元凶”

解决方法

（1）检查电极方向：胶负膜正，黑负红正。转膜的方向是从胶的（负极）方向转到膜的方向（正极）。转膜仪负极一般为黑色，正极为红色或白色。

（2）检测转膜缓冲液，注意转膜缓冲液与电泳缓冲液不一样，pH需稳定在8.3-8.6。不宜长时间保存，避免长箘后不稳定。

（3）判断转膜效果，丽春红染膜是一种简单其常用的判断转膜效率的方法，且可逆不影响后续的抗体孵育效果。将转膜后的膜完全浸入溶液，摇床振荡1-10分钟（常规3分钟），待膜上出现清晰红色条带后，立即用去离子水或PBS冲洗至背景透明（约1-5分钟）。若条带清晰且颜色均匀则转膜效果好，若条带模糊或颜色较浅，则转膜不完全。

（4）预染Marker判断转膜效率。预染Marker简单直观，根据转印膜上Marker的清晰度以及凝胶上是否有残留判断转膜效率。理想情况是转膜后只在膜上看到Marker条带，胶或滤纸上几乎没有条带存在。如果在胶上看到较多Marker残留，可以增加转膜的电压、电流或时间，降低凝胶厚度，如从1.5 mm改为1 mm。

（5）大分子蛋白转膜优化，适当延长转膜时间，比如300 mA，60-90 min或更长，或4℃湿转低电流过夜。在转膜液中加入终浓度为0.5‰左右的SDS，有利于蛋白从凝胶中释放。将转膜液中甲醇的浓度降到10%或更低，防止蛋白沉淀。

（6）小分子蛋白根据分子量大小选择合适的膜和转膜条件。如20-75 kDa蛋白看选用孔径0.45 μm的膜，转膜条件为300 mA，30 min左右，转膜缓冲液中甲醇浓度20%。小于20 kDa的蛋白选用0.22 μm的膜，转膜条件为300 mA，15-20 min或200 mA，20-25 min，甲醇浓度可提高到25%。已有实验用乙醇替代甲醇。小分子转印要确保转膜液中不含SDS。

不必过度清洗膜，一般清洗3次，每次5-10 min，足以洗掉非特异性结合。1%的Tween-20可增强洗涤效果，适当减少洗膜强度（如3次，5 min）。TBST中添加20%甲醇也会提高洗涤效率。