鲎试剂用了40年，为什么欧美药典开始转向重组C因子法？内毒素检测的"去动物化"趋势不可阻挡？

内毒素的主要成分是来自于革兰氏阴性菌外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），LPS是先天免疫细胞的强效刺激物，对抵御病原体入侵机体至关重要。LPS与细胞的结合过程复杂，涉及多种受体蛋白，如脂多糖结合蛋白（LBP）、膜结合型或可溶型CD14、膜蛋白MD-2及Toll样受体TLR4。

研究表明，即使微量内毒素也能驱动单核细胞和巨噬细胞产生大量细胞因子，引发发热、休克甚至器官损伤。此外，内毒素还通过促进蛋白聚集、破坏细胞正常生长，影响实验结果的准确性。在生物制药过程中，内毒素水平过高可能会导致药效降低并带来安全风险。因此，全球药典与监管标准均设定了严格的限度要求，包括美国药典（USP）、欧洲药典（EP）、中国药典及ISO 23500等。其中，USP<85>对常见生物制品内毒素限度的参考值为≤0.5EU/mg。

 

内毒素控制：预防为主，去除为辅

内毒素稳定性极强，对温度、酸碱都有较高的耐受性。常规121℃湿热灭菌几乎不会对内毒素造成破坏，需250℃加热约30分钟或180℃加热约3小时才能显著降低其活性。NaOH虽能破坏内毒素，但会增加设备清洗和维修成本。0.22μm的除菌过滤膜能去除微生物，但无法去除内毒素。

 

在生物制药和生物制品领域，内毒素污染一直是产品质量控制的难题。在生产过程中，水源、原辅料、培养基、表达系统、生产设备等各个环节，都存在内毒素污染的风险，因此“无菌”并不等于“无内毒素”。设备可用强碱灌洗并用注射水清洗来去除内毒素，但对于原辅料和培养基等难以做到有效去除，需要在源头做好内毒素检测，选用内毒素含量低的产品。义翘神州ProPure^®超低内毒素重组蛋白的内毒素水平低至0.05 EU/mg以下，最适合用于临床前动物研究、准确的细胞检测和检测分析。

 

内毒素检测方法：从传统到新兴技术

美国药典最早收载的内毒素检测方法是家兔热原检查法，随后引入了基于鲎试剂的检测方法。近年来，重组C因子法已被欧美药典收载，用做鲎试剂法的替代方法。除此之外，一些新兴的检测技术也在快速发展，如电化学检测、高效液相色谱法（HPLC）、石英晶体微天平（QCM）、分子印迹技术等。新方法以蛋白质、抗体或适配体结合为基础，并结合金纳米颗粒、量子点、纳米管和磁性纳米颗粒等纳米材料实现信号放大。

 

家兔热原法（Rabbit Pyrogen Test，RPT）

PRT法是通过将样本注射到兔子体内，并观察体温变化情况来判断是否含有内毒素。如果样本中有内毒素，兔子体温会在注射3-6小时后升高0.5℃以上。此方法仅能定性检测，灵敏度低，且依赖活体动物，容易受到个体差异影响。RPT不能用于药品生产过程中的质量控制，也不适用于放射性活肿瘤抑制剂等毒性大的药物，因此已逐渐被淘汰。

 

鲎试剂法（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）

鲎试剂试验法是目前使用最广泛的内毒素检测方法。从鲎中提取的蓝色血液含有C因子、B因子和凝固蛋白原，内毒素在二价阳离子的参与下将其激活，生成凝聚酶，最终形成凝胶、浊度或颜色变化。LAL的灵敏度比RPT高10-100倍，且不需要活体动物，但依赖于鲎的血液提取物。

LAL主要分为三种方法：凝胶法、显色法和比浊法。

凝胶法是将鲎血液提取物与样品等体积混合，若形成凝胶且混合物在管底保持完整，则检测结果为阳性。表明样品中的内毒素含量至少达到了引发阳性反应的水平，检测限为0.03-0.06 EU/mL。此法操作简单经济，不需要专用设备，可用于定性或半定量检测。

显色法和比浊法属于光度检测法。显色法是用显色或有色底物替换提取物中的凝固蛋白原，通过分光光度计测量溶液的吸光度。比浊法与此类似，通过测定溶液浊度评估鲎试剂与内毒素作用后的凝固情况。浊度和吸光度的变化速率与内毒素浓度成正比，需要使用光学读数仪器进行分析，检测限更高，可用于定量检测。

以上三种LAL方法均基于鲎血液中存在C因子凝血级联反应。内毒素在激活C因子后会进一步激活B因子，形成凝血酶。在凝胶法和比浊法中，凝血酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白，从而形成凝胶或浊化试剂。显色法是酶将显色底物裂解，使悬浮液显色，颜色的深浅与溶液中内毒素的浓度成正比。

 

图1. 鲎试剂对内毒素的免疫防御机制及LAL检测内毒素的原理

（源自文献：doi: 10.1002/bit.27362）

 

重组C因子法（recombinant Factor C，rFC）（H3）

重组因子C是通过基因重组技术表达制备的、对内毒素敏感的重组蛋白，用于替代天然鲎试剂。rFC检测的原理是内毒素激活重组因子C，后者裂解荧光底物氨基甲基香豆素，进而生成荧光化合物。该方法可以在96孔板上进行，使用380/440 nm激发/发射波长对荧光强度进行测定。荧光强度的差值与样品中的内毒素浓度成正比。rFC专用于内毒素检测，检测灵敏度在0.05-500 EU/mL之间。rFC无动物源性，减少对鲎的伤害，无因子G干扰，避免葡聚糖导致的假阳性。

 

表1. 内毒素的检测方法对比

检测方法		灵敏度（EU/mL）	使用场景
鲎试剂LAL	凝胶法	0.03-0.06	常规筛查、半定量
	显色法	0.005	复杂基质（如血清、细胞培养基）
	浊度法	0.001	高精度定量（如注射剂）
重组C因子法（rFC）		0.01	替代LAL，定量检测

 

义翘神州采用LAL和rFc方法检测内毒素浓度，产品生命全周期严格监控内毒素水平。从源头开始使用无内毒素的质粒和缓冲液，生产过程中选用低内毒粘性的实验器材及定期在位清洗（CIP）系统，生产体系不使用大肠杆菌表达或引入大肠杆菌，尽可能降低革兰氏阴性菌的污染，确保重组蛋白产品内毒素水平低至0.05 EU/mg。

 

义翘神州ProPure™超低内毒素蛋白及定制服务

义翘神州位于德克萨斯州的生物工程中心（C4B）采用先进的技术和设备生产ProPure™超低内毒素蛋白，内毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），显著优于行业标准（USP <85>：0.5 EU/mg），适用于临床前动物研究、严格的细胞实验与高敏检测分析。同时，C4B还提供超低内毒素蛋白定制服务，满足临床前和药物开发中对内毒素控制的更高标准需求。

超低内毒素蛋白产品列表（热门靶点）

货号	分子	种属	纯度
10440-H17H-B-UE	Alkaline Phosphatase	Human	≥ 95% (SEC-HPLC)
10279-H08H-UE	AXL	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
91085-C02H-UE	CD155/PVR	Cynomolgus	≥ 95% (SEC-HPLC)
10977-H08H-UE	CD3e	Human	≥ 95%
11150-H08H-UE	CD69	Human	≥ 90%
CT081-H2508H-UE	CD79A & CD79B	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
11077-H08H-UE	CEACAM-5/CD66e	Human	≥ 95% (SEC-HPLC)
11996-H08H-UE	c-Kit	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
10694-H08H-UE	EpCAM/TROP1	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
16044-H08H-UE	FGFR3	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
10004-H08H-UE	Her2/ERBB2	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)
CT022-M08H-UE	IL12A & IL12B	Mouse	≥ 90%
10369-H01H-UE	IL-13	Human	≥ 90% (SEC-HPLC)

 

参考文献：

Mason Schneier, et al. Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. Biotechnology and Bioengineering. 2020, DOI: 10.1002/bit.27362