ELISpot试剂盒验证数据及常见问题QA

酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot）技术可在单细胞层面上对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测。对比传统ELISA技术，ELISpot检测的灵敏度更高，且检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原的功能。ELISpot是一种关键的检测方法，已广泛应用于感染性疫苗和肿瘤疫苗的临床药效学评估、细胞与基因治疗的临床免疫原性评估等。

义翘神州在抗体开发及生物分析方法开发领域拥有深厚的技术经验，自主研发了高品质的ELISpot检测试剂盒，可精准检测IFN-γ、IL-2、IL-4等多种关键细胞因子，为疫苗研发、免疫治疗、药物筛选等领域的研究提供了有力支持。此外，义翘神州提供一站式的ELISpot检测服务，以及支持完整的方法学验证，满足客户的不同需求。

 

ELISpot检测示意图

 

产品验证数据

Mouse IFN-γ ELISpot Kit (ALP) (Cat#: EK50709A)

 

The statistical histogram and representative plate images of mouse IFN-γ ELISpot assays. Splenocytes isolated from BALB/c mice were plated in graded densities (5×10⁴–2.5×10⁵ cells/well) and stimulated with Concanavalin A (ConA) for 20 h. Wells containing cells without stimulation served as the negative control.

 

客户案例分享：评估病毒疫苗诱导的细胞免疫应答

实验目的：采用IFN-γ ELISpot法评估病毒疫苗诱导的细胞免疫应答
检测因子：Mouse IFN-γ
客户评价：斑点清晰，背景干净，实验结果优于进口品牌
使用产品：Mouse IFN-γ ELISpot Kit (ALP) (Cat#: EK50709A)

 

 

ELISpot检测服务

义翘神州拥有先进的酶联免疫斑点分析仪，能够实现对ELISpot板上各孔斑点图像进行全自动采集、计数及分析，支持疫苗、药物筛选、细胞治疗等领域的研究。我们提供专业的ELISpot检测服务，可根据客户的具体需求，量身定制合适的检测分析方案，提供严格的方法学验证，并出具详细的分析结果报告。另外，我们还提供ELISpot读板服务，利用仪器进行自动读板分析，为客户提供每孔的斑点原始图像和斑点数结果。

·服务范围
疫苗评价、药物筛选、免疫原性检测等

·服务周期
3-5天

·交付内容
斑点分析结果报告

 

ELISpot实验常见问题及改进建议

问题描述	可能原因	改进建议
PVDF膜背景深，着色重	洗板不彻底	提高洗板次数，每次浸泡1分钟
	膜未完全干燥	确保PVDF膜完全干燥后再读板
阴性对照孔出现斑点	培养基、血清或DMSO中的内毒素等污染物激活细胞，导致非特异性斑点产生	使用无内毒素的试剂
	细胞被污染	在处理板和细胞孵育过程中注意程严格无菌操作
	细胞存活率低	优化细胞分离流程，确保细胞活率 >90%，保持功能性
斑点形状不规则或成团	细胞破损	优化细胞提取流程，确保细胞活性
	细胞聚集	铺板前充分混匀细胞悬液，确保单细胞状态
阳性对照孔斑点数少或斑点模糊	酶活力下降	提高酶浓度
	显色试剂温度低，出现氧化现象	使用前将显色试剂平衡至室温，避免使用已氧化沉淀试剂
	刺激物效价低	提高刺激物浓度
斑点位置不均匀，存在边缘效应	铺板后移动板子，细胞移位	铺板后避免移动，轻拿轻放，平移放入培养箱
	加刺激物时冲击力大，冲散细胞	改为先加刺激物后加细胞
	板子堆放导致热量不均	每块板单独放置于培养架上，确保热量均匀分布
读板时即使对参数进行了调整，但孔中斑点密集，无法识别全部斑点	细胞过多，斑点融合在一起	减少每孔加入的细胞数量

 

ELISpot技术常见问题解答

（1）ELISpot技术原理是什么？

ELISpot技术是一种基于抗原抗体反应的免疫学检测技术，能够检测单个细胞分泌细胞因子/抗体的能力，对样本中活细胞免疫状态进行动态监测评估。该技术被广泛应用于疫苗研究、药物筛选、感染性疾病诊断与研究、肿瘤免疫研究、自身免疫病研究、过敏研究等。

 

（2）ELISpot和ELISA的区别是什么？
虽然ELISpot和ELISA的工作原理都是基于抗原抗体反应，但两者有一定的区别。ELISA检测的是所有细胞分泌的目标分子总量，而ELISpot则在单细胞水平上直接检测分泌目标分子的细胞。下表详细介绍了ELISpot和ELISA的区别。

 

ELISpot和ELISA的对比

区别	ELISpot	ELISA
原理	都是基于抗原抗体反应，ELISPot实际上是ELISA的延伸和新的发展
测定对象	样品细胞在检测过程中新鲜分泌的蛋白分子	样品溶液中的已经存在的、均匀分布的蛋白分子
检测板	PVDF膜96孔板	普通96孔酶标板
检测方式	通过显色反应，在分泌可溶性蛋白的细胞位置显现清晰斑点，进行计数，从而计算出分泌该蛋白的细胞频率	通过显色反应，测吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白的含量
检测设备	ELISpot分析仪	酶标仪
灵敏度	极高	较低
实验时间	较长（通常24-48h）	较短（通常几个小时内）

 

（3）ELISpot的优势有哪些？

ELISpot技术具有多种显著优势，包括：

•超高灵敏度：百万分之一阳性细胞检测率，比ELISA灵敏度高百倍

•单细胞水平检测：单个细胞的分泌，而非细胞群体的平均分泌

•活细胞功能检测：检测到的目标分子不是已存在的，而是在检测过程中，被加入的刺激物刺激而分泌出来的

•直观、可信度高：一个阳性细胞一个斑点，斑点数量代表分泌目标分子的细胞数量多少，斑点大小代表该细胞分泌目标分子水平的多少

•高通量检测：一块ELISpot板可作96 test，每天可检测数百个样品

•冻存细胞适用：经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能，也可用于ELISpot实验

 

（4）在ELISpot板上，每孔应该加入多少数目的淋巴细胞？
在ELISpot实验中，每孔加入的淋巴细胞数量需根据具体实验进行调整，一般不宜超过4×105个/孔。使用ConA、PHA等阳性刺激物时，一般加入的淋巴细胞数为1×104～2×105个/孔。使用特异性抗原作为刺激物时，每孔细胞数量可在1×105～4×105个。使用多克隆刺激物时，应适当降低细胞数量以避免斑点重叠，确保实验结果的准确性。

 

（5）冻存的细胞能否用于ELISpot？
一般更推荐使用新鲜制备的细胞进行ELISpot实验，因为新鲜细胞的活性和功能通常更为稳定，能够提供更可靠的实验结果。冻存的细胞也能用于ELISpot实验中，但是细胞的状态对实验结果有很大影响，因此必须严格遵循标准化的冻存和复苏流程以保证获得高活力的细胞。

 

（6）什么是预包被的ELISpot孔板？
预包被的ELISpot是即用型的试剂盒，其孔板已在无菌条件下预先包被了最佳浓度的捕获抗体，使用起来也更加方便，省略了乙醇活化和抗体包被这两个步骤。义翘神州提供高质量的预包被ELISpot检测试剂盒，经PDVF板包被、无菌干燥、真空密封包装等工艺流程制备，批次间一致性高，满足疫苗研发、免疫学研究等领域的高通量检测需求。

 

（7）在分离外周血淋巴细胞过程中若发生溶血，是否会影响实验结果？

溶血后产生的细胞碎片、血红素等杂质很可能悬浮于分离液界面，在吸取外周血单个核细胞（PBMC）时极易被混入样品中。由于这些细胞碎片和血红素难以彻底清除，在进行 ELISpot实验时，它们可能沉积于培养板孔底部，严重干扰细胞因子与捕获抗体的特异性结合，进而对实验结果产生不良影响。

 

义翘神州ELISpot试剂盒

 

分子	货号	产品名称
IFN-γ	EK11725A	Human IFN-γ ELISpot Kit (ALP)
	EK50709A	Mouse IFN-γ ELISpot KIT (ALP)
	EK50709B	Mouse IFN-γ ELISpot Kit (ALP) (Strips)
IL-2	EK11848A	Human IL-2 ELISpot Kit (ALP)
	EK51061A	Mouse IL-2 ELISpot Kit (ALP)
IL-4	EK11846A	Human IL-4 ELISpot Kit (ALP)
	EK51084A	Mouse IL-4 ELISpot Kit (ALP)
	EK51084B	Mouse IL-4 ELISpot Kit (ALP) (Strips)
TNF-α	EK50349A	Mouse TNF-α ELISpot Kit (ALP)

 

更多ELISpot试剂盒产品即将上线，敬请关注！

 

性能媲美进口品牌，还有多重好礼等你来领！